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Q: 如何選擇合適的內(nèi)參基因？

A：常見物種做mRNA使用actin做內(nèi)參，miRNA檢測使用U6做內(nèi)參，特殊物種根據(jù)文獻(xiàn)選擇合適的內(nèi)參。對(duì)于一些無法確定內(nèi)參的物種，我們可以提供內(nèi)參基因篩選服務(wù)，選出穩(wěn)定的內(nèi)參用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Q: 引物出現(xiàn)非特異怎么解決？

A：提高退火溫度；減少引物量；重新設(shè)計(jì)引物。

Q: 絕對(duì)定量與相對(duì)定量有什么區(qū)別？

A：絕對(duì)定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說的拷貝數(shù)。相對(duì)定量的目的是測定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對(duì)比例，而不需要知道它們在每個(gè)樣本中的拷貝數(shù)。絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對(duì)定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)有兩種方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和CT值比較法。如果使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，可以使用絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，也可以使用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，而且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)驗(yàn)操作上更為簡便易行。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品是只知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)品，典型的做法是將一個(gè)已知pg數(shù)的樣品做一系列梯度稀釋。

Q: 每個(gè)反應(yīng)管中可以加入多少種探針？

A：每個(gè)反應(yīng)管中可以加入的探針數(shù)目，取決于儀器、軟件、試劑和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等幾個(gè)方面。

首先是儀器的硬件構(gòu)成和軟件的解析能力。在軟件解析能力足夠的前提下，全波長檢測的定量PCR儀如激光管-CCD類型對(duì)于探針的數(shù)量實(shí)際上是沒有限制的。如果信號(hào)的采集要通過濾色片，那么探針的數(shù)量取決于濾色片的數(shù)目，增加探針需要增加或改變?yōu)V色片。改動(dòng)儀器的結(jié)構(gòu)通常很困難。以ABI公司的儀器為例，7900和7700是激光-全波長檢測的，7000、7300是4色濾色片的，7500是5色濾色片的。

其次是化學(xué)上的可能性。不同的熒光基團(tuán)要組合到一起，在同一反應(yīng)管內(nèi)使用，必須其激發(fā)波長既相對(duì)靠近又不能靠得太近，既保證信號(hào)激發(fā)的效率又保證信號(hào)不重疊干擾，能夠區(qū)分清楚。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的熒光基團(tuán)種類有限，滿足這樣條件的分子組合更少。目前的最佳組合只能達(dá)到每組4到5種熒光的水平。

第三是實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和選用的探針類型。定量PCR實(shí)驗(yàn)必須使用ROX校正熒光，占去一種熒光；TaqMan探針的淬滅基團(tuán)(TAMRA)也要占用一種熒光，對(duì)于4色檢測的儀器來說，只剩下2種熒光可以標(biāo)記探針，對(duì)于5色檢測的儀器還有3種熒光可以使用。如果將探針改用TaqMan MGB探針，由于它的淬滅基團(tuán)是不發(fā)熒光的，比之TaqMan探針就可以多1種熒光用于標(biāo)記探針。如果實(shí)驗(yàn)要求不高，不做ROX校正（AB公司不推薦這樣做），還可以再多一種熒光用于標(biāo)記探針。

第四是研究應(yīng)用本身的要求。如果研究SNP和基因突變，因?yàn)榻^大多數(shù)人類基因是2態(tài)的，只存在兩種等位基因，2條探針已經(jīng)足夠。如果研究基因表達(dá)，通常是兩兩比較居多，比如處理比未處理，正常比異常等，加上一個(gè)內(nèi)對(duì)照，3色也就足夠了。

最后是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高數(shù)據(jù)精確度，二是節(jié)省反應(yīng)成本。同時(shí)測定的基因越多，成本也越低。但是加入4-5種探針，就要同時(shí)加入8-10條引物。在引物設(shè)計(jì)的時(shí)候要考慮到盡量減少這些引物之間的競爭和抑制等多種干擾，平衡各對(duì)引物之間的PCR效率。雖然這是可以做到的，但是要花費(fèi)大量時(shí)間、人力和物力來篩選最佳引物組合、優(yōu)化反應(yīng)條件。如果實(shí)驗(yàn)規(guī)模不大，在總體上可能反而不合算。

在實(shí)際應(yīng)用中，不是單純追求加入的探針越多越好，而是追求總體效益的最優(yōu)化。比較切合實(shí)際的是2到3重反應(yīng)，引物和探針的設(shè)計(jì)不太困難，反應(yīng)條件的優(yōu)化也不太麻煩，同時(shí)降低了成本。

Q: 什么是雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法？

A：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法是指將內(nèi)參基因及目的基因分別稀釋5個(gè)點(diǎn)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確保擴(kuò)增效率，再根據(jù)絕對(duì)定量的數(shù)據(jù)計(jì)算差異表達(dá)情況。